減少?gòu)U水中的氮化合物是改善水環(huán)境和水質(zhì)的重要措施之一。與傳統(tǒng)硝化/反硝化工藝相比，短程硝化/厭氧氨氧化(partialnitrification/anaerobicammoniaoxidation，PN/A)工藝可以將脫氮需氧量降低50%，有機(jī)碳需求量降低100%，污泥產(chǎn)量降低90%。因此，PN/A工藝被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、最有前景的脫氮工藝。

反應(yīng)器內(nèi)生物質(zhì)的保留能力對(duì)厭氧氨氧化(Anammox)工藝的啟動(dòng)周期有著重要影響。據(jù)報(bào)道，顆粒和生物膜污泥都具備良好的生物質(zhì)截留能力 ，但已知這兩種污泥形式分別單獨(dú)運(yùn)行時(shí)都會(huì)存在較長(zhǎng)的啟動(dòng)時(shí)間。生物膜系統(tǒng)形成周期短，但長(zhǎng)期運(yùn)行后載體上太厚的生物膜會(huì)導(dǎo)致生物質(zhì)脫落并被水流沖刷。Anammox顆粒污泥的形成是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，但可以有效地?cái)r截污泥流失并保持較高的生物量。因此，生物膜和顆粒污泥的組合應(yīng)用可能最大程度上保留反應(yīng)器內(nèi)生物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)PN/A的快速啟動(dòng)和功能菌的高效富集。然而，將好氧生物膜和厭氧顆粒相結(jié)合來啟動(dòng)PN/A工藝目前尚未見報(bào)道。

不同于傳統(tǒng)的單階段和兩階段PN/A反應(yīng)器，在多級(jí)PN/A反應(yīng)器中，交替的缺氧室和好氧室不僅為(anaerobicammoniaoxidizingbacteria(AnAOB)和ammoniaoxidizingbacteria(AOB)這2種功能細(xì)菌的同時(shí)生長(zhǎng)和富集提供了空間條件，而且在缺氧區(qū)亞硝酸鹽氮(NO2--N)和氨氮(NH4+-N)共存的環(huán)境有利于厭氧氨氧化菌的自然富集。此外，實(shí)現(xiàn)PN/A工藝的關(guān)鍵不僅需要同時(shí)富集AOB和AnAOB，還必須盡可能抑制亞硝酸鹽氧化菌(nitriteoxidizingbacteria，NOB)活性。據(jù)報(bào)道，間歇曝氣和pH控制等策略可以有效控制PN/A工藝中不同菌群的活性(富集AnAOB和AOB，抑制NOB)。然而，具有間歇曝氣、pH控制、多級(jí)反應(yīng)器和生物膜/顆粒污泥系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)的組合PN/A反應(yīng)器的運(yùn)行策略仍需要研究。

本研究構(gòu)建了由3個(gè)好氧反應(yīng)柱和3個(gè)厭氧反應(yīng)柱組成的新型多級(jí)好氧生物膜/厭氧顆粒反應(yīng)器(multistageaerobic-biofilm/anaerobic-granularsludgereacto，MOBAPR)，以同時(shí)促進(jìn)AnAOB和AOB的富集。本研究的主要目的為：擬通過MOBAPR實(shí)現(xiàn)PN/A工藝的快速啟動(dòng)和高效運(yùn)行；考察MOBAPR各反應(yīng)柱的氮轉(zhuǎn)化過程；探索不同MOBAPR柱中功能菌豐度的變化和微生物群落結(jié)構(gòu)的差異；通過優(yōu)化氣液比(gas/liquidratio，G/L)，進(jìn)一步提高PN/A工藝的脫氮效率(nitrogenremovalefficiency，NRE)。

1、材料與方法

1.1 進(jìn)水水質(zhì)與接種污泥

接種物取自中國(guó)江西省贛州市白塔生活污水處理廠的剩余污泥(普通活性污泥)。在第1天分別向每個(gè)反應(yīng)柱加入100mL接種物，其活性污泥濃度(MLSS)大約為5100mg·L-1。

本研究采用模擬廢水(含150mg·L-1 NH4+-N)，其改編自前人研究。主要成分包括0.708g·L-1 (NH4)2SO4，1.05g·L-1 NaHCO3，0.02g·L-1 KH2PO4，0.022g·L-1 MgSO4，0.008g·L-1 CaCl2，1.25mg·L-1營(yíng)養(yǎng)液I(5g·L-1 EDTA、0.00625g·L-1 FeSO4)和營(yíng)養(yǎng)液II(15g·L-1 EDTA、0.43g·L-1 ZnSO4·7H2O、0.25g·L-1 CuSO4·5H2O、0.19g·L-1 NiCl2·6H2O、0.99g·L-1 MnCl2·4H2O、0.24g·L-1 CoCl2·6H2O、0.22g·L-1 NaMoO4·2H2O、0.014g·L-1 H3BO4)。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

MOBAPR的示意圖如圖1所示。該反應(yīng)器由6個(gè)高30cm、直徑4.5cm的有機(jī)玻璃柱相互串聯(lián)構(gòu)成，總有效容積為2.5L。從進(jìn)水到出水的6個(gè)反應(yīng)柱(reactioncolumn，Rc)分別標(biāo)記為Rc1、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6(隔室數(shù)量可根據(jù)出水水質(zhì)增減)。在好氧反應(yīng)柱(Rc1、Rc3和Rc5)中添加無紡布作為填料，并采用間歇曝氣。厭氧隔室(Rc2、Rc4和Rc6)采用低速攪拌裝置。當(dāng)PN工藝成功啟動(dòng)后停止攪拌。曝氣量由玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)調(diào)節(jié)，并采用自動(dòng)斷電定時(shí)器電路實(shí)現(xiàn)間歇曝氣。根據(jù)之前的報(bào)道 ，由蠕動(dòng)泵(Langer，BT101L，UK)、pH控制器(WEIPRO，pH-2010B，China)和NaOH溶液組成的pH控制系統(tǒng)將MOBAPR中的pH保持在8.2~8.5。在每次曝氣15min后開始檢測(cè)DO(dissolvedoxygen)質(zhì)量濃度。

1.3 運(yùn)行條件

本研究在MOBAPR中依次啟動(dòng)PN和PN/A工藝。第I階段(1~7d)，為快速恢復(fù)硝化細(xì)菌(AOB和NOB)的活性，在好氧區(qū)((Rc1、Rc3和Rc5)中連續(xù)曝氣，并在厭氧區(qū)(Rc2、Rc4和Rc6)連續(xù)攪拌。此外，此階段由于污泥處于懸浮狀態(tài)，會(huì)隨著進(jìn)水流動(dòng)，因此，啟動(dòng)污泥回流以保證反應(yīng)器內(nèi)充足的生物質(zhì)含量。第II階段(8~15d)為抑制NOB，在好氧區(qū)中使用間歇曝氣。第III階段(16~60d)好氧區(qū)微生物已成功掛膜生長(zhǎng)，基本沒有污泥流失，停止回流。此外，為進(jìn)一步抑制NOB，第29天水力停留時(shí)間(hydraulicresidencetime，HRT)降低至8h(16~28d的HRT為12h)。第IV階段(61~86d)為避免攪拌影響厭氧區(qū)AnAOB富集，厭氧區(qū)停止攪拌。第V階段(87~110d)，調(diào)整曝氣量以保證反應(yīng)器內(nèi)充足的NO2--N。各階段運(yùn)行參數(shù)詳見表1。在第VI階段(111~162d)，在進(jìn)水NH4+-N為150mg·L-1和好氧/厭氧時(shí)間為90min/30min條件下，分別調(diào)節(jié)曝氣量和HRT來探討不同G/L對(duì)NRE的影響。

1.4 分析方法

實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)器內(nèi)NH4+-N、NO2--N、NO3--N的檢測(cè)分析均根據(jù)《水和廢水檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法》中制定的方案，使用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的紫外/可見分光光度計(jì)(SQ2800，意大利UNICO)進(jìn)行測(cè)定，包括納氏試劑分光光度法(NH4+-N)(1-萘基)-乙二胺分光光度法(NO2--N)和氨基磺酸紫外分光光度法(NO3--N)。此外，為了更好地揭示MOBAPR中PN/A過程的氮轉(zhuǎn)化機(jī)理，每天對(duì)各反應(yīng)柱的氮質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，并分析其亞硝酸鹽積累率(nitriteaccumulationrate，NAR)、氨氮去除率(ammonianitrogenremovalrate，ANR)、氮去除率(NRE)、氮負(fù)荷率(nitrogenloadrate，NLR)和氮去除負(fù)荷(nitrogenremovalloadrate，NRR)。

1.5 16SrRNA基因測(cè)序與微生物菌群分析

為探索MOBAPR中不同階段微生物群落的演變，闡明連續(xù)多階段PN/A過程中所涉及的生物學(xué)機(jī)制，分別對(duì)接種物、第56天(階段III)和第110天(階段V)的泥樣進(jìn)行微生物功能菌群分析。接種物命名為A0，第III階段在Rc1~Rc6收集的污泥樣品分別命名為A1、A2、A3、A4、A5和A6，第V階段分別命名為B1、B2、B3、B4、B5和B6。這些樣本保存在-20℃，直到提取DNA結(jié)束。

在成功提取樣本內(nèi)微生物的DNA后，使用16SrRNA基因的通用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且PCR產(chǎn)物使用AxyPrep™DNA凝膠提取試劑盒(AxygenBiosciences，UnionCity，USA)按照制造商的說明進(jìn)行純化。然后通過IlluminaMiSeq測(cè)序平臺(tái)(PE300)對(duì)樣品高通量測(cè)序，并得到原始測(cè)序序列。為了解樣本測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬、物種功能等信息，將在Miseq測(cè)序得到的原始序列數(shù)據(jù)利用cutadapt(version1.18)和PRINSEQ(version0.20.4)軟件進(jìn)行去除引物接頭序列、拼接、識(shí)別的處理以得到各樣本的有效數(shù)據(jù)。然后利用Usearch(version11.0.667)按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類。然后利用RDPclassifier(version2.12)等軟件進(jìn)行OTU物種分類，并根據(jù)得到的OTU序列進(jìn)行微生物菌群分析與功能預(yù)測(cè)。

1.6 優(yōu)化MOBAPR操作

由于在第V階段DO值較低，MOBAPR的性能無法通過DO來進(jìn)行控制。因此，在第VI(111~162d)，階段，為了代替DO控制(當(dāng)DO低至無法控制)，本研究提出了一種新型控制參數(shù)—?dú)庖罕?/span>(式(1))。分別在2、4、6和8h的HRT條件下調(diào)控曝氣量(0.05、0.1、0.15和0.2L·min-1)，從而得到G/L比為2.4、4.8、7.2、9.6、4.4、19.2、21.6、28.8和38.4。并且在每次操作條件調(diào)整后，MOBAPR連續(xù)運(yùn)行3~4d。此外，利用高斯模型預(yù)測(cè)了G/L與NRE之間的相關(guān)性(式(1))。

式中：q為G/L值；t為HRT，h；v為曝氣速率，L·min-1；V為MOBAPR的總有效容積，L。

2、結(jié)果與討論

2.1 MOBAPR中PN/A工藝的脫氮性能

1)接種物馴化。階段I(1~7d)在進(jìn)水NH4+-N為150mg·L-1、曝氣速率為0.02L·min-1、DO為2~4mg·L-1和HRT24h的條件下運(yùn)行MOBAPR。如圖2所示，出水NO3--N由64.03mg·L-1增加到122.71mg·L-1。這說明在被重新接種后，硝化細(xì)菌(AOB和NOB)的活性在高DO水平下得到了快速恢復(fù)。此外，在階段I中NRE大多低于零(圖2(c))。這可能是一些細(xì)菌(主要是異養(yǎng)菌)不能適應(yīng)無碳源下的MOBAPR，細(xì)菌死亡后細(xì)胞溶解釋放出額外的氮源到反應(yīng)器內(nèi)。

2)PN工藝的啟動(dòng)。在階段II(8~15d)，MOBAPR的pH為8.3，好氧區(qū)平均溶解氧為0.5mg·L-1，間歇曝氣(好氧/厭氧時(shí)間為80min/40min)。結(jié)果表明，NO2--N由0mg·L-1增加到106.89mg·L-1(圖2(b))，NO3--N由122.71mg·L-1減少到20.92mg·L-1(圖2(d))，這表明NOB被有效抑制的同時(shí)AOB成功富集。因此，此階段PN工藝在MOBAPR成功啟動(dòng)。此外，PN工藝中的NO2--N穩(wěn)定供應(yīng)是實(shí)現(xiàn)Anammox工藝的前提 ，其關(guān)鍵是高效穩(wěn)定地抑制反應(yīng)器中的NOB活性。有研究表明，控制pH和間歇曝氣是抑制NOB活性的重要手段。因此，將以上2種抑制策略的結(jié)合是實(shí)現(xiàn)PN過程快速啟動(dòng)的關(guān)鍵。

在階段III(16~60d)，出水NO3--N逐漸增加，第16~28天處于較高水平(30~46mg·L-1)。因此，要實(shí)現(xiàn)PN過程的穩(wěn)定運(yùn)行，需要對(duì)控制條件進(jìn)行調(diào)整。在第17天好氧區(qū)在已經(jīng)形成穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu)后，MOBAPR停止回流。結(jié)果NAR短暫升至81%，然后逐漸下降(圖2(b))。在第20~28天，出水NO3--N相對(duì)穩(wěn)定(30~41mg·L-1)，說明綜合控制策略仍能有效抑制NOB活性。第29天，HRT由12h縮短到8h，出水NO3--N由29.2mg·L-1逐漸降至16.7mg·L-1，NAR也增加到90%。因此，HRT是影響PN工藝穩(wěn)定性的重要參數(shù)，HRT過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生額外的NO3--N。

隨著PN過程成功啟動(dòng)和AOB被富集積累 ，反應(yīng)器中DO被AOB大量消耗，這導(dǎo)致厭氧區(qū)室中的DO質(zhì)量濃度降低至0.2mg·L-1左右，從而為厭氧菌提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。由圖2(c)可知，NRE由5.51%逐漸增加到25.52%。這表明AnAOB可能在此階段自然富集。有研究表明，AOB是從微需氧甚至厭氧的祖先進(jìn)化而來的，在亞硝酸氧化還原酶(NXR)和其他反射蛋白的形式上與AnAOB高度相似。MIAO等的研究結(jié)果同樣表明接種硝化污泥可以縮短Anammox的啟動(dòng)時(shí)間。因此，基于PN工藝，AnAOB可能更容易富集。此外，高通量測(cè)序結(jié)果表明階段III中AnAOB的增加。

3)PN/A工藝的啟動(dòng)與運(yùn)行。有研究 表明，較大污泥絮凝物中的AnAOB具有更高的活性。厭氧區(qū)中污泥絮體的生長(zhǎng)可能會(huì)受到攪拌的限制，從而抑制AnAOB的活性。因此，在階段IV(61~86d)停止攪拌以增加AnAOB的活性。并且有研究表明，NO2--N質(zhì)量濃度越高越有利于Anammox的積累。因此，延長(zhǎng)好氧區(qū)的相對(duì)曝氣時(shí)間以進(jìn)一步增加反應(yīng)器中NO2--N質(zhì)量濃度。在第IV階段，厭氧區(qū)中停止攪拌，并且好氧區(qū)中好氧/厭氧時(shí)間從80min/40min變?yōu)?/span>90min/30min。在第61天后，MOBAPR的TN質(zhì)量濃度逐漸下降，由126.96mg·L-1(第61天)降低至(32.79±6.21)mg·L-1(77~86d)，NRE也從21.5%迅速增加到(78.86±4.6)%(圖2(c))。這表明在本研究采用的操作策略下，61d內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)PN/A工藝的快速啟動(dòng)。

此外，隨著AnAOB成功富集，MOBAPR中脫氮速率增加，導(dǎo)致進(jìn)水中大部分的NH4+-N在Rc1~Rc4中已經(jīng)被去除，而Rc5和Rc6中功能微生物缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，有必要適當(dāng)縮短HRT以保證MOBAPR中功能微生物的進(jìn)一步富集。在階段V(87~110d)，HRT由8h縮短至6h。此階段反應(yīng)穩(wěn)定后(102~110d)，出水NO2--N、NO3--N和NH4+-N質(zhì)量濃度分別為(0.63±0.50)、(16.72±1.78)和(8.29±6.65)mg·L-1。其中，出水NO3--N質(zhì)量濃度(NO3--N產(chǎn)生/NH4+-N去除=0.12)與Anammox的NO3--N理論產(chǎn)生值(NO3--N產(chǎn)生/NH4+-N去除=0.11)接近，這表明NOB被穩(wěn)定抑制。此外，PN/A工藝的NRE、ANR和NRR分別為(83.41±2.45)%、(97±3.61)%和(0.41±0.09)kg·(m3·d)-1(圖2)。這表明該操作策略可用于MOBAPR，以實(shí)現(xiàn)PN/A過程的長(zhǎng)期高效穩(wěn)定運(yùn)行。

有趣的是，在第IV和第V階段(曝氣量分別為0.08L·min-1和0.10L·min-1)，所測(cè)得DO質(zhì)量濃度接近0。有研究 表明，當(dāng)AOB的耗氧速率高于曝氣效率，反應(yīng)器曝氣后的DO質(zhì)量濃度仍會(huì)保持在較低水平。因此，在MOBAPR中非曝氣后，好氧區(qū)的曝氣會(huì)被AOB等好氧細(xì)菌及時(shí)轉(zhuǎn)化，從而維持反應(yīng)器內(nèi)低DO水平。此外，在MOBAPR中，AOB的富集是AnAOB快速啟動(dòng)的關(guān)鍵。AOB不僅可以為AnAOB創(chuàng)造環(huán)境，還提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然而AOB主要在好氧區(qū)活性較高。因此，在整個(gè)啟動(dòng)期間，基本不對(duì)厭氧區(qū)進(jìn)行直接調(diào)控(攪拌停止后)。

2.2 各階段微生物群落演替分析

為了探索MOBAPR中微生物群落的變化規(guī)律，對(duì)接種物、第56天(第III階段末期)和第110天(第V階段)末期采集的污泥樣品進(jìn)行微生物群落進(jìn)行分析。其中PA1為接種物A0，PA2為第III階段各反應(yīng)柱(A1、A2、A3、A4、A5和A6)內(nèi)微生物豐度的平均值，PA3為第V階段(B1、B2、B3、B4、B5和B6)微生物豐度的平均值。高通量測(cè)序得到的優(yōu)質(zhì)細(xì)菌序列被劃分為不同的分類類別(門和屬)，結(jié)果如圖3(a)和圖3(b)所示。Proteobacteria包括具有硝化反硝化功能的細(xì)菌 ，是門水平上的主要細(xì)菌(圖3(a))。Proteobacteria在接種物中的豐度為68.15%，而在階段III和階段V后分別下降到44.68%和40.39%(圖3(a))。這表明在變形菌門中許多異養(yǎng)硝化或反硝化細(xì)菌由于有機(jī)物的缺乏而被淘汰。有研究表明，Planctomycete門中不僅擁有一些專性好氧菌，還包含了所有已知的AnAOB。接種物(PA1)中的Planctomycete相對(duì)豐度接近第III階段(PA2)，分別為4.07%和3.71%。而到了第V階段(PA3)，Planctomycete豐度達(dá)到10.85%，這表明Planctomycete主要在第III階段后被富集。此外，在屬水平上PA1的CandidatusKuenenia的相對(duì)豐度極低，約0.05%(圖3(b))。這表明在接種物中幾乎不含AnAOB。與接種物(PA1)相比，PA2和PA3中Armmonadetes和Chloroflexi的豐度顯著增加(圖3(a))。有研究表明，在Armarmadetes和Chloroflexi中的許多細(xì)菌含有與氮代謝相關(guān)的功能基因(Nar、NirK或Nos)。因此，Armatimonadetes和Chloroflexi可能含有多種AOB和AnAOB協(xié)同細(xì)菌，為PN/A工藝的啟動(dòng)和運(yùn)行做出了貢獻(xiàn)。

圖3(b)反映了PN/A工藝中所有樣品在屬水平上的微生物群落。在第III階段Nitrosomonas的豐度由1.49%增加到28.20%(圖3(b))，證實(shí)了該操作策略可以成功富集AOB。并且，16s結(jié)果表明CandidatusKuenenia是MOBAPR中主要的AnAOB，其由接種物PA1(0.05%)增長(zhǎng)到2.97%。這表明隨著PN工藝的長(zhǎng)期運(yùn)行，此階段(第56天)AnAOB開始富集。在第V階段，PN/A工藝啟動(dòng)成功并長(zhǎng)期運(yùn)行后，Nitrosomonas (27.09%)和CandidatusKuenenia(9.99%)的豐度得到了較高程度富集，這表明AOB和AnAOB在MOBAPR中可以同時(shí)富集。因此，通過第IV和第V階段的綜合運(yùn)行策略，AOB和AnAOB作為優(yōu)勢(shì)菌被富集，并形成細(xì)菌協(xié)同關(guān)系完成脫氮。此外，NOB的主要菌屬Nitrobacter、Nitrospira和Nitrospina等可能由于含量太低(<0.1)，均未被檢測(cè)到。

2.3 不同階段各反應(yīng)柱內(nèi)的氮轉(zhuǎn)化途徑

1)氮轉(zhuǎn)化途徑分析。為了更深入地了解MOBAPR各反應(yīng)柱內(nèi)PN/A工藝的氮轉(zhuǎn)化過程，對(duì)PN(階段III)和PN/A工藝(階段V)長(zhǎng)期運(yùn)行階段分別進(jìn)行測(cè)試分析，結(jié)果如圖4所示。在第III階段，出水NO2--N質(zhì)量濃度從Rc1到Rc6逐漸增加，NH4+-N相應(yīng)降低(圖4(a))。這表明各反應(yīng)柱內(nèi)均參與到氨氧化過程中。每個(gè)反應(yīng)柱內(nèi)都含有NH4+-N和NO2--N(圖4(a))，這為AnAOB的富集提供了必要條件。并且由于氨氧化過程需要氧氣參與，好氧區(qū)(Rc1、Rc3和Rc5)內(nèi)的ANR顯著高于厭氧區(qū)(Rc2、Rc4和Rc6)(圖4(c))。此外，NO3--N濃度一直處于較低水平(<10mg·L-1)(圖4(a))，這表明通過本研究采用的操作策略，NOB活性長(zhǎng)期受到有效抑制。在這一階段，MOBAPR的平均氮損失約為30mg·L-1(圖4(a))，證實(shí)了反硝化細(xì)菌或AnAOB的增加。特別是Rc1、Rc3和Rc5中NRE的增加也顯著高于Rc2、Rc4和Rc6(圖4(e))，說明好氧區(qū)內(nèi)氮損失主要是反硝化細(xì)菌或AnAOB造成的。

在第V階段，由于進(jìn)水中的氨(150mg·L-1)通過前4個(gè)反應(yīng)柱被PN/A完全轉(zhuǎn)化，最后2個(gè)反應(yīng)柱(Rc5和Rc6)在此階段被廢棄。模擬廢水在流經(jīng)Rc4后被排出。如圖4(b)所示，在此階段出水NH4+-N降至較低水平。這表明經(jīng)過長(zhǎng)期運(yùn)行，PN/A工藝的NRE有所提高。此外，由圖4(d)可以看出，大部分氨氧化過程基本在Rc1完成，而在Rc4之后脫氮量達(dá)到最高(圖4(f))。此外，在第V階段各反應(yīng)柱內(nèi)NO2--N含量低于階段III(圖4(a))，這表明由AOB產(chǎn)生的NO2--N被AnAOB快速利用，即AnAOB與AOB之間形成了良好的協(xié)同脫氮效果。Rc1和Rc3中NRE和ANR均顯著增加(圖4(f))，因此，PN和Anammox過程主要在好氧室中進(jìn)行。這是由于在好氧區(qū)內(nèi)形成了內(nèi)層為AnAOB和外層AOB的微生物生物膜協(xié)同脫氮系統(tǒng)。依賴于外部的AOB提供的NO2--N，內(nèi)部的厭氧微生物將剩余的氨轉(zhuǎn)化為氮。其中，由圖4(f)可知，厭氧區(qū)(Rc2和Rc4)中NRE的增加遠(yuǎn)低于好氧區(qū)(Rc1和Rc3)，并且厭氧區(qū)的出水NO2--N幾乎為0(圖4(b))。因此，NO2--N的缺乏可能限制了厭氧區(qū)的NRE。此外，在MOBAPR的好氧室中添加填料形成生物膜系統(tǒng)，不僅有效避免了DO對(duì)AnAOB的抑制，而且還有利于AnAOB的富集。在此階段穩(wěn)定的生物膜和顆粒污泥系統(tǒng)分別在好氧區(qū)和厭氧區(qū)形成。一方面，在好氧區(qū)的生物膜系統(tǒng)中形成了分層分布的好氧外層和厭氧內(nèi)層。AnAOB在厭氧環(huán)境的生物膜內(nèi)層得到富集，并與外層AOB協(xié)同脫氮。另一方面，AOB產(chǎn)生的大部分NO2--N被生物膜內(nèi)層的AnAOB利用，剩余少量NO2--N流出并被位于厭氧區(qū)的AnAOB顆粒污泥消耗。此階段在好氧區(qū)的脫氮方式與單階段PN/A工藝相似，而厭氧區(qū)脫氮方式與兩階段PN/A工藝相似。因此，生物膜和顆粒污泥結(jié)構(gòu)成功將單階段與兩階段PN/A工藝的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起，不僅具備兩階段PN/A更快的啟動(dòng)速度，還具備單階段PN/A的更高效的反應(yīng)速率。

2)各反應(yīng)柱中AOB和AnAOB的動(dòng)態(tài)分析。為了探究在PN工藝和PN/A工藝長(zhǎng)期運(yùn)行過程中，MOBAPR中不同反應(yīng)柱內(nèi)微生物群落的差異，對(duì)接種污泥、階段III和階段V獲得的污泥樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。其中，接種污泥樣品命名為A0，在第56天(階段III)Rc1、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6采集的樣品分別命名為A1、A2、A3、A4、A5和A6，在第110天(階段V)采集的樣品命名為B1、B2、B3、B4、B5和B6。高通量測(cè)序得到的相關(guān)參數(shù)如表2所示。厭氧區(qū)中的Simpson指數(shù)明顯低于好氧區(qū)(表2)，這說明好氧區(qū)的物種富集程度是高于厭氧區(qū)的，Shannon指數(shù)也得到了類似的結(jié)論。每個(gè)污泥樣品的覆蓋率超過99.70%(表2)，說明高通量測(cè)序基本代表了污泥樣品的實(shí)際微生物群落結(jié)構(gòu)。

為深入了解好氧生物膜/厭氧顆粒污泥的微生物分布情況，在階段III和階段V，從MOBAPR中的6個(gè)反應(yīng)柱中獲得的污泥樣品進(jìn)行了微生物群落分析。PN工藝啟動(dòng)并長(zhǎng)期運(yùn)行后，A1、A3和A5中亞硝基單胞菌(Nitrosomonas)的相對(duì)豐度分別從1.49%提高到30.99%、39.77%和40.74%，A2、A4和A6中亞硝基單胞菌的相對(duì)豐度分別從1.49%提高到11.42%、22.25%和22.15%(圖5(c))，這證實(shí)了AOB在每個(gè)隔間中都被富集。厭氧區(qū)中AOB的富集與好氧區(qū)出水的DO有關(guān)。因此，厭氧區(qū)的AOB豐度明顯低于好氧區(qū)(圖5(c))。此外，在A1、A2、A3、A4、A5和A6中，AnAOB(CandidatusKuenenia)的豐度分別由0.05%提高到0.16%、5.25%、0.56%、5.87%、0.39%和5.06%(圖5(c))，這表明AnAOB已經(jīng)開始富集。AOB不僅通過消耗溶解氧為AnAOB創(chuàng)造厭氧環(huán)境還為AnAOB提供必需的基質(zhì)(NO2--N)。因此，此階段Nitrosomonas富集可能為Anammox的啟動(dòng)奠定了基礎(chǔ)。

在PN/A工藝成功啟動(dòng)和運(yùn)行后(第V階段)，B1、B2、B3和B4中CandidatusKuenenia的豐度分別增加到12.67%、19.07%、12.41%和11.43%(圖5(a))。由于Rc5和Rc6中NO2--N的缺乏，B5和B6中CandidatusKuenenia的豐度較低(分別為0.24%和2.29%)。在各反應(yīng)柱中，Nitrosomonas和CandidatusKuenenia都得到了較高水平的積累(圖5(b))。這證實(shí)了微生物之間協(xié)同脫氮系統(tǒng)的存在。有趣的是，CandidatusKuenenia不僅被富集在厭氧區(qū)，而且在好氧區(qū)中也有較高的豐度，這表明好氧區(qū)已形成分層分布的生物膜系統(tǒng)。此外，在PN/A工藝的長(zhǎng)期運(yùn)行階段，未分類菌數(shù)量較多(圖5(c))。有研究表明，PN/A工藝微生物群落由各種功能菌和協(xié)作菌共同組成的。因此，在演替過程中會(huì)出現(xiàn)一些未分類協(xié)作菌以促進(jìn)功能菌更好的富集。

2.4 G/L對(duì)NRE的影響

在第V階段，MOBAPR中的DO值接近于零。一方面，不能通過控制DO值來進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)器性能；另一方面，不能人為直接調(diào)控DO值，即只能通過曝氣量或流量等來間接調(diào)控DO值。因此，在PN/A工藝在運(yùn)行過程中，DO控制會(huì)存在一定的滯后性。此外，在此階段發(fā)現(xiàn)曝氣速率越高，厭氧菌活性會(huì)降低；而曝氣速率越低，厭氧菌的氮轉(zhuǎn)化性能同樣會(huì)將低。因此，在MOBAPR中提供合適的曝氣量非常重要。

第2.1節(jié)和2.2節(jié)中的結(jié)果表明可通過縮短HRT將MOBAPR的NRE進(jìn)一步提高，但好氧區(qū)中AOB的需氧量隨著進(jìn)水氨氮濃度的增加而增加。因此，本研究通過控制G/L，一方面可以為MOBAPR中的功能微生物提供穩(wěn)定適宜的NO2--N/NH4+-N，從而促進(jìn)MOBAPR的總氮去除率；另一方面，直接調(diào)控反應(yīng)器參數(shù)(代替DO控制)，從而簡(jiǎn)化操作。為探討G/L對(duì)總氮去除率的影響，通過調(diào)節(jié)曝氣量和HRT，在進(jìn)水NH4+-N為150mg·L-1，好氧/厭氧時(shí)間為90min/30min條件下，G/L參數(shù)分別設(shè)置為2.4、4.8、7.2、9.6、14.4、19.2、21.6、28.8和38.4。用高斯模型對(duì)得到的NRE和相應(yīng)的G/L進(jìn)行擬合(極點(diǎn)擬合)以得出最適G/L，擬合結(jié)果如圖6所示。可以看出，PN/A工藝的NRE在G/L為0~19.2時(shí)增大，而在G/L為21.6~38.4時(shí)減小。高斯模型的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9922(圖6(b))，說明該模型較好地描述了NRE與G/L之間的關(guān)系。模型擬合結(jié)果表明，當(dāng)G/L比值參數(shù)為20~30時(shí)，NRE可達(dá)到較高水平。

3、結(jié)論

1)本研究構(gòu)建了厭氧和好氧區(qū)共存、懸浮污泥系統(tǒng)與生物膜系統(tǒng)相結(jié)合的MOBAPR。

2)在MOBAPR中15天內(nèi)成功啟動(dòng)PN工藝，PN/A工藝在61天內(nèi)成功啟動(dòng)。在運(yùn)行階段，PN工藝的NAR為(87.35±2.7)%，PN/A工藝的NRE為(83.41±2.45)%。

3)高通量測(cè)序結(jié)果表明，Nitrosomonas(27.09%)和CandidatusKuenenia(9.99%)在厭氧區(qū)和好氧區(qū)被同時(shí)富集。在長(zhǎng)期運(yùn)行階段，PN工藝的NAR為(87.35±2.7)%，PN/A工藝的NRE為(83.41±2.45)%。

4)在DO低至無法控制時(shí)，G/L可能是一種可以代替DO控制的重要策略，并且高斯模型擬合結(jié)果表明，當(dāng)G/L比值參數(shù)為20~30時(shí)，NRE可達(dá)到較高水平。（來源：中交(天津)生態(tài)環(huán)保設(shè)計(jì)研究院有限公司）